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核受体LRH-1调控转运体OAT2和多西他赛药动学的研究

作者:喻芳君
  • 作者:喻芳君
  • 学位授予单位:暨南大学
  • 授予学位:硕士
  • 需要金币:10
  • 添加日期:2019-04-13 14:31
  • 下载地址:无链接信息!
论文介绍及目录
目的:OAT2(Organic anion transporter 2/有机阴离子转运蛋白2)是一种SLC家族摄取转运体,在药物转运与处置中扮演重要角色。解析OAT2表达的调控因子对深入理解药物的动力学行为及其影响因素等具有重要意义。核受体LRH-1(Liver receptor homolog 1/肝受体同系物-1)是一重要转录调节因子,调控多种转运体和代谢酶的表达。然而,LRH-1是否调控OAT2尚不明确。本课题旨在考察LRH-1对OAT2的调控效应,以及阐明调控作用机制。方法:1.分别采用基因高表达和siRNA沉默技术,高表达或敲低Lrh-1。采用实时荧光定量法、蛋白免疫印迹法对Oat2的表达进行检测。采用底物孵育法对Oat2的活性进行测定。2.采用双荧光素酶报告基因技术,考察核受体Lrh-1对Oat2启动子转录活性的影响。结合截断启动子报告基因分析方法,分析核受体Lrh-1与Oat2启动子的作用区域。采用凝胶迁移和染色质免疫共沉淀等生物学技术解析作用位点。3.采用siRNA沉默技术,敲低Lrh-1。采用UPLC-QTOF/MS法,测定不同浓度和不同时间孵育条件下细胞内多西他赛浓度,评价Lrh-1对多西他赛摄取活性的影响。4.基于Lrh-1肝特异性敲除(Lrh-1~(hep-/-))和野生型(Lrh-1~(fl/fl))小鼠模型,采用实时荧光定量法和蛋白免疫印迹法,检测Lrh-1~(hep-/-)和Lrh-1~(fl/fl)小鼠肝脏中基因和蛋白的表达。5.分别采用Lrh-1~(hep-/-)和Lrh-1~(fl/fl)小鼠进行多西他赛药代动力学研究。腹腔注射给予多西他赛(10 mg/kg)。于不同时间点采集血样和肝脏,采用UPLC-QTOF/MS法测定血浆及肝脏药物浓度。基于非房室模型,评价多西他赛在Lrh-1~(hep-/-)和Lrh-1~(fl/fl)小鼠中药动学及组织分布差异。结果:1.核受体LRH-1/Lrh-1调控肝癌细胞中OAT2/Oat2的表达在Hepa1-6细胞中,高表达Lrh-1后,Oat2 m RNA表达升高1.2倍,蛋白表达升高80%;敲低Lrh-1后,Oat2 mRNA表达降低62%,蛋白表达降低55%。此外,敲低Lrh-1后,Hepa1-6细胞对PGE2的摄取减少77%。同时,在HepG2细胞中高表达或敲低LRH-1后,OAT2 mRNA表达也相应升高或降低。2.Lrh-1肝脏敲除下调小鼠Oat2的表达检测结果显示,Lrh-1在Lrh-1~(hep-/-)小鼠肝脏中不表达。Lrh-1的肝脏缺失导致Oat2mRNA表达降低80%。同时,Oat2蛋白在Lrh-1~(hep-/-)小鼠肝脏中表达降低78%。3.核受体Lrh-1为Oat2的转录激活剂双荧光素酶报告基因结果显示,Lrh-1显著增强Oat2启动子活性。Oat2启动子活性与Lrh-1表达量呈正相关。截断启动子报告基因分析显示,Lrh-1调节Oat2启动子活性的核心区域位于-1.1和-0.4 kb之间(即-716至-702 bp区域)。EMSA实验结果显示,Oat2特异性探针与Lrh-1蛋白形成明显的DNA-蛋白复合物。体内CHIP实验结果显示,Lrh-1抗体募集Oat2-LrhRE序列显著增加。数据表明,Lrh-1通过其特异性结合于Oat2启动子-716至-702bp区域而激活Oat2的转录。4.Lrh-1敲低降低多西他赛细胞摄取体外不同时间和不同浓度摄取实验结果显示,敲低Lrh-1后,Hepa1-6细胞对多西他赛的摄取显著降低。数据表明,敲低Lrh-1后Oat2蛋白表达的降低将直接引起Oat2对其底物摄取的减少。5.Lrh-1肝特异性敲除改变多西他赛药动学体内药动学实验结果显示,特异性敲除肝脏Lrh-1后,多西他赛的药动学发生明显改变。与Lrh-1~(fl/fl)小鼠相比,Lrh-1~(hep-/-)小鼠血浆药物暴露量明显增加。相反,在2小时时间内,Lrh-1~(hep-/-)小鼠肝脏中多西他赛浓度相对较低。同时,多西他赛其它肝摄取转运蛋白在Lrh-1~(hep-/-)小鼠肝脏中未发生改变。数据表明,Lrh-1通过调控Oat2的表达来改变肝脏对多西他赛的摄取,从而调节多西他赛的药代动力学及组织分布。结论:本研究首次揭示核受体Lrh-1在转运体Oat2和多西他赛药代动力学调节中的关键作用。Lrh-1通过转录调控Oat2的表达,从而影响Oat2底物药代动力学和组织分布。本研究将有助于理解Oat2底物药物的体内过程,为Oat2底物药物的个体化剂量设置提供参考。

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